摘要：隨著生物學(xué)走入“分子時(shí)代”，基因編輯工具成為有力的科研武器，尤其是簇狀規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列（CRISPR）基因編輯技術(shù)的出現(xiàn)，為基礎(chǔ)和應(yīng)用生物學(xué)研究帶來了巨大的變革。

使用 CRISPR，我們能夠識(shí)別并快速地改變目標(biāo)基因、診斷疾病、預(yù)測(cè)個(gè)體的疾病易感性，應(yīng)用 CRISPR 的農(nóng)業(yè)產(chǎn)物已經(jīng)走進(jìn)現(xiàn)實(shí)，CRISPR 邁出進(jìn)入臨床醫(yī)學(xué)的第一步已然不遠(yuǎn)……曾幾何時(shí)，人類基因組測(cè)序需 5 年才能完成；如今，24 小時(shí)內(nèi)獲取完整序列已經(jīng)變得可行。

CRISPR 是一門年輕的技術(shù)，它何以具有如此之大的能量？

近期，因開發(fā) CRISPR 基因編輯技術(shù)于2020年獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)的 Jennifer Doudna 在《科學(xué)》雜志撰文[1]，回顧了過去十年中 CRISPR 基因編輯的起源和應(yīng)用、當(dāng)前成果、局限性，并討論了未來的發(fā)展方向。就讓我們跟隨這篇文章一起來看看 CRISPR 的騰飛之旅。

1987年，一篇論文首次將 CRISPR 帶入人類的視野[2]。CRISPR 是在微生物基因組中發(fā)現(xiàn)的一組規(guī)律重復(fù)的基因序列，它常與編碼 CRIPSR 相關(guān)蛋白（Cas）的基因一同出現(xiàn)。有趣的是，這些短重復(fù)序列竟然與病毒中的部分序列匹配[3]。

原來，CRISPR 系統(tǒng)其實(shí)是微生物的一種自我防御系統(tǒng)，通過 CRISPR 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物識(shí)別、Cas 蛋白切割來破壞病毒的 DNA 或 RNA，以此防御病毒入侵[4]。而這一運(yùn)作系統(tǒng)的簡(jiǎn)單和精巧使其具有了成為基因編輯工具的可能。

目前使用最廣泛的是被認(rèn)為是第三代基因編輯技術(shù)的 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)，由攜帶的引導(dǎo) RNA（guide RNA）來識(shí)別序列，Cas9 蛋白（一種 RNA 指導(dǎo)的 DNA 內(nèi)切核酸酶）切割 DNA，因此可以廣泛地靶向不同的序列。通過改變 Cas9 蛋白活性位點(diǎn)的氨基酸，也可以僅切斷 DNA 單鏈或者僅結(jié)合不切割，由此實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄抑制、激活、沉默、上調(diào)等多種基因調(diào)控目的[5]。對(duì) Cas 蛋白的進(jìn)一步改造，也提供了單堿基編輯、染色質(zhì)修飾、序列插入、靶向 RNA 等多樣的應(yīng)用方向[6]。

CRISPR 技術(shù)的出現(xiàn)為多種疾病治療提供了基礎(chǔ)，包括鐮狀細(xì)胞病（SCD）、乙型地中海貧血、轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白（TTR）淀粉樣變性、先天性眼病等遺傳疾病，乃至癌癥、艾滋病毒感染等常見病；CRISPR 技術(shù)已經(jīng)在農(nóng)作物和家畜育種方面取得成果，比如更耐熱應(yīng)激的奶牛（slick-coat cattle）及更有營(yíng)養(yǎng)的番茄；而在基礎(chǔ)研究上，CRISPR 作為有力的科研工具，加速了分子和細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域的研究，在數(shù)千篇論文中起到了作用。

接下來，就讓我們來具體了解一下 CRISPR 這個(gè)優(yōu)秀的科研工具箱。

CRISPR 結(jié)構(gòu)精巧靈活、可塑性極強(qiáng)，不同 CRISPR 體系具有多種功用，接下來我們選取其中使用較為廣泛的三類進(jìn)行介紹。

基因敲除是 CRISPR 最主要的應(yīng)用之一，真核細(xì)胞中普遍使用 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)，由工程單導(dǎo) RNA（sgRNA）將 Cas9 核酸酶引導(dǎo)到目標(biāo)位點(diǎn)，制造 DNA 雙鏈斷裂（DSB），由非同源末端連接（NHEJ）和同源定向修復(fù)（HDR）等內(nèi)源性修復(fù)途徑修復(fù)。

這種技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于基因敲除動(dòng)物模型的創(chuàng)建，由于繞過了傳統(tǒng)手段的復(fù)雜胚胎干細(xì)胞篩選過程，培育時(shí)間大大縮短，培育轉(zhuǎn)基因小鼠的時(shí)長(zhǎng)從 1 年縮短到了 4 周[7]。同時(shí)，大多數(shù)哺乳動(dòng)物并沒有成熟的胚胎干細(xì)胞系，通過 CRISPR-Cas9 也能夠促進(jìn)新物種的動(dòng)物模型出現(xiàn)。

在生殖細(xì)胞編輯之外，CRISPR-Cas9 也可以用于體細(xì)胞編輯，這避免了部分基因全身敲除的致命影響，在特定場(chǎng)景下也更有利于模擬癌癥的演變和進(jìn)展以及確定癌癥治療的新策略[8]。

利用 CRISPR，研究者已經(jīng)制造了多種疾病的動(dòng)物模型，包括酪氨酸血癥、杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良、癌癥、骨質(zhì)疏松、亨廷頓舞蹈癥、肌萎縮型側(cè)索硬化癥、阿爾茨海默病和艾滋病等[9]。

當(dāng)通過 CRISPR 并行執(zhí)行針對(duì)多個(gè)基因的遺傳改變，就是 CRISPR 篩選。由于靈活高效，CRISPR 可以方便地引入基因擾動(dòng)，可以深入研究單個(gè)基因擾動(dòng)如何影響目標(biāo)細(xì)胞的功能，又或是在混合篩選中對(duì)數(shù)千個(gè)擾動(dòng)進(jìn)行高通量測(cè)序[10]。當(dāng) gRNA 文庫(kù)達(dá)到基因組規(guī)模，研究者可以輕易使用 CRISPR 來擾動(dòng)人類基因組中的每一個(gè)基因[11]。

在 CRISPR 敲除（CRISPR KO）篩選之外，CRISPR 干擾（CRISPRi）篩選和 CRISPR 激活（CRISPRa）篩選也是常用的可逆的控制基因表達(dá)的篩選方法[12]；飽和基因組編輯（saturation genome editing）能夠產(chǎn)生所有可能的單核苷酸多態(tài)性（SNPs）用于功能篩選[13]；后文會(huì)介紹的單堿基編輯技術(shù)能夠以更高效率引入點(diǎn)突變，或許會(huì)成為 CRISPR 篩選的新助力。

CRISPR 篩選已經(jīng)在類器官、動(dòng)物、植物等復(fù)雜模型中實(shí)際應(yīng)用，它目前是分析癌基因功能的常用方法，還可以用于識(shí)別各種癌癥驅(qū)動(dòng)因素和調(diào)節(jié)因素[10]。

結(jié)合其他技術(shù)，CRISPR 篩選同樣可用于細(xì)胞表型篩選、腫瘤耐藥性篩選等等領(lǐng)域，比如 Procode、Perturb-ATAC、Perturb-seq 和 ECCITE-seq 等多組學(xué)篩選技術(shù)。

單堿基編輯技術(shù)提供了一種在不切斷 DNA 雙鏈的情況下進(jìn)行基因編輯的新可能，這一方面可以產(chǎn)生精確的點(diǎn)突變，一方面無需復(fù)制模板且限制了多余的副產(chǎn)物。

單堿基編輯系統(tǒng)通常由不具有催化 DSB 活性的 dCas9、dCas12a、dCas13b 等 Cas 蛋白和堿基脫氨酶融合組成，sgRNA 將融合酶引導(dǎo)到目標(biāo)位點(diǎn)，脫氨酶進(jìn)行化學(xué)修飾，通過細(xì)胞修復(fù)機(jī)制處理堿基不匹配。在過去的幾年里，DNA 和 RNA 單堿基編輯已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了 C＞T、A＞G、C＞G、A＞I和C＞U 轉(zhuǎn)換突變。

點(diǎn)突變是人類致病遺傳變異的主要類別，單堿基編輯技術(shù)為治療人類遺傳疾病鋪平了道路。單堿基編輯已經(jīng)在多種小鼠模型中表現(xiàn)出了糾正功能喪失突變的良好效果，例如體內(nèi)單堿基編輯糾正小鼠 Hutchinson-Gilford 早衰綜合征[14]。使用單堿基編輯技術(shù)治療家族性高膽固醇血癥的早期臨床試驗(yàn)已經(jīng)開始，近期將開展的還有針對(duì)鐮狀細(xì)胞病的臨床研究[15]。

隨著 CRISPR 基因編輯技術(shù)進(jìn)入下一個(gè)十年，還有一些關(guān)鍵的問題需要解決，其中一個(gè)就是編輯的精度。這既指編輯目標(biāo)位點(diǎn)的特異性，也指編輯結(jié)果的準(zhǔn)確性。

為減少意外結(jié)合和切割導(dǎo)致的脫靶效應(yīng)，研究者利用合理的設(shè)計(jì)開發(fā)了高保真Cas變體，例如SpCas9-HF1、evoCas9、HiFiCas9和 Cas9_R63A/Q768A 等變體，亦或是設(shè)計(jì)了優(yōu)化的導(dǎo)向方法，例如 E-Crisp、CasOFFinder、sgDesigner。近期，也有研究開發(fā)了機(jī)器學(xué)習(xí)工具來預(yù)測(cè)基因編輯結(jié)果，但目前尚未得到體內(nèi)研究的驗(yàn)證[16]。

傳統(tǒng)編輯中，DSB 后涉及 NHEJ 或 HDR 通路的修復(fù)(前者容易出錯(cuò)，可能導(dǎo)致突變，后者雖更精確，但發(fā)生率非常低)，這會(huì)導(dǎo)致一系列插入缺失突變（indels）。避免這個(gè)問題的其中一個(gè)思路就是提高 HDR 效率和/或抑制NHEJ，例如使用單鏈寡脫氧核苷酸模板[17]、通過控制細(xì)胞周期階段來促進(jìn) HDR [18]、使用位點(diǎn)特異性 Cas9 寡核苷酸偶聯(lián)物將 DNA 模板募集到目標(biāo)位點(diǎn)[19]。但在這些方法之下仍存在 DSB 相關(guān)的大量基因位點(diǎn)缺失和染色體重排風(fēng)險(xiǎn)，可能導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定。

避免產(chǎn)生DSB則是另一個(gè)思路，堿基編輯（base editing，BE）和引導(dǎo)編輯（prime editing，PE）是目前的主要方法。不過 BE 也存在旁觀者編輯的問題，當(dāng)編輯窗口中存在多個(gè)目標(biāo)堿基時(shí)，BE 的編輯精度會(huì)大大降低[20]。Cas 蛋白識(shí)別特定原間隔序列鄰近基序（PAM），受此限制，縮小編輯窗口也存在一定困難，這還需要結(jié)合多種輔助策略來改善。PE 同樣不涉及 DSB，且能夠?qū)崿F(xiàn) DNA 序列的插入，但目前 PE 的編輯效率還比較低[21]。

限制 CRIPSR 應(yīng)用的另一個(gè)環(huán)節(jié)是 CRISPR 的遞送。目前在哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中存在多種遞送方法，可以大致分為物理遞送、病毒遞送和基于合成材料的遞送。常用的物理方法包括微注射和電穿孔，傳遞效率高且劑量可控，但這局限于體外遞送；病毒遞送常用腺相關(guān)病毒（AAV）、腺病毒（AdVs）和慢病毒等載體，其中 AAV 在臨床研究中應(yīng)用較多，但病毒載體存在載量、免疫原性、制造成本等多種潛在問題；脂質(zhì)納米顆粒（LNPs）、陽離子聚合物、多肽和納米金（gold nanoparticles，GNPs）等合成材料載體通常較為安全可控，LNPs 是首次成功用于治療TTR淀粉樣變性的遞送載體[22]。

體內(nèi)環(huán)境對(duì) CRISPR 遞送具有多種阻礙，載體需避免降解、調(diào)理素作用、吞噬導(dǎo)致從血管滲出，有效穿過狹窄間隙，并在內(nèi)吞時(shí)釋放內(nèi)含物。CRISPR 治療人類疾病能夠發(fā)展到何種程度，很大程度上將取決于當(dāng)前遞送方法的改進(jìn)、新遞送方法的創(chuàng)建和設(shè)計(jì)更緊湊的 CRISPR 編輯系統(tǒng)。

可編程基因編輯技術(shù)的出現(xiàn)為細(xì)胞和基因治療的應(yīng)用鋪平了道路。已有大量應(yīng)用 CRISPR 的臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行，其中關(guān)于 SCD 的至少已有 8 項(xiàng)正在進(jìn)行或即將開始，預(yù)計(jì) 2023 年內(nèi) FDA 會(huì)啟動(dòng)至少一項(xiàng)療法的批準(zhǔn)[23]。隨著臨床應(yīng)用的擴(kuò)大，CRISPR 也有可能成為預(yù)防神經(jīng)退行性疾病和心血管疾病的一種手段[24]。

CIRSPR 也對(duì)農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響，CRISPR 編輯的食品已經(jīng)進(jìn)入市場(chǎng)，包括營(yíng)養(yǎng)價(jià)值更高的番茄和兩種已獲批在日本銷售的魚類。CRISPR 精準(zhǔn)編輯的特點(diǎn)非常適合定向育種，可以同時(shí)敲除和激活不同的基因，例如給小麥引入抗病性的同時(shí)增加小麥的產(chǎn)量[25]。

CRISPR-Cas9 和 CRISPR-Cas12a 是目前應(yīng)用最廣的編輯系統(tǒng)，已經(jīng)在全世界各地的實(shí)驗(yàn)室得到了廣泛的應(yīng)用。這加速了基礎(chǔ)研究的進(jìn)展，也倒推了 CRISPR 工具箱的擴(kuò)展。結(jié)合機(jī)器學(xué)習(xí)、活細(xì)胞成像、DNA 測(cè)序技術(shù)， CRISPR 還能做到更多。

下一個(gè)十年，CIRSPR 還將繼續(xù)改變世界。

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