牛痘病毒加帽體系利用牛痘病毒加帽酶及相關(guān)組分，將 7-甲基鳥(niǎo)苷帽結(jié)構(gòu)（m7Gppp，Cap0）加到RNA的5′末端。在真核生物中，該結(jié)構(gòu)與mRNA的穩(wěn)定、轉(zhuǎn)運(yùn)和翻譯密切相關(guān)。使用酶促反應(yīng)為RNA加帽是一種簡(jiǎn)單有用的方法，且帽結(jié)構(gòu)與自然Cap 0結(jié)構(gòu)一致，能顯著改善用于體外轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)染和顯微注射的RNA的穩(wěn)定性和翻譯能力。這種酶由兩個(gè)亞基（D1 和D12）組成，D1亞基執(zhí)行RNA三磷酸酶和鳥(niǎo)苷轉(zhuǎn)移酶的功能，D12亞基執(zhí)行鳥(niǎo)嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶的功能，它們對(duì)于添加一個(gè)完整的Cap 0結(jié)構(gòu)m7Gppp5′N都是必須的。 

本體系可用于IVT RNA的加帽反應(yīng)，使加帽反應(yīng)在1h之內(nèi)完成，效率接近完整，并且保證正確的方向。IVT推薦使用蛋白質(zhì)T7 High Yield RNA Transcription kit。

體內(nèi)或體外翻譯前 mRNA的加帽和mRNA的5’末端標(biāo)記。

SAM：需事先計(jì)算好SAM的用量，在反應(yīng)開(kāi)始前把分裝的32mM的儲(chǔ)備液稀釋成2mM的工作液。SAM在pH7-8，37°C條件下不穩(wěn)定，需要在反應(yīng)開(kāi)始之前新鮮配置。為避免SAM降解，該工作液需要保存于冰上。 

RNA：在加帽體系使用之前，應(yīng)將體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)生的RNA進(jìn)行純化并溶解于RNase-free水中，不能將RNA溶解在EDTA溶液或其他鹽溶液中。 

RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)：一些RNA轉(zhuǎn)錄本可能形成穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)（同源二聚體和發(fā)卡結(jié)構(gòu)），如二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生在轉(zhuǎn)錄本的5'端會(huì)影響加帽效率。在與加帽酶反應(yīng)之前加熱RNA可以去除轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5′端的二級(jí)結(jié)構(gòu)，如果轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的5′端結(jié)構(gòu)復(fù)雜，可以把加熱時(shí)間延長(zhǎng)到10min，加帽反應(yīng)時(shí)間可延長(zhǎng)到60min。 

Cap 0-和Cap 1-mRNA：Cap 0-和Cap 1-mRNA之間的差異在RNA 5'端緊鄰帽結(jié)構(gòu)的一位核苷酸（N1）是否具有 2'-O-甲基。在高等真核細(xì)胞中，該甲基化是自然加帽過(guò)程的一部分，Cap 1結(jié)構(gòu)提高了mRNA的翻譯效率。 

Vaccinia Capping System可以與mRNA Cap 2′-O-Methyltransferase在一個(gè)體系內(nèi)同時(shí)工作產(chǎn)生Cap 1結(jié)構(gòu)。當(dāng)使用新的細(xì)胞系或翻譯系統(tǒng)時(shí)，建議比較Cap 0-和Cap 1-mRNA翻譯效率和免疫原性，以確定合適的帽子結(jié)構(gòu)。 

Poly(A) 尾：如果加帽的RNA需要添加3'-poly(A)尾巴，可以使用蛋白質(zhì)E.coli. Poly(A) Polymerase進(jìn)行加尾。加帽和加尾后的RNA需在進(jìn)行RNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前做純化處理。 

RNase Inhibitor：在配置反應(yīng)體系時(shí)，可以加入0.5μl蛋白質(zhì)RNase inhibitor，同時(shí)去掉等體積的RNase-free水。 

RNA5’端標(biāo)記：在用于RNA 5′端標(biāo)記時(shí)，GTP 儲(chǔ)備液應(yīng)稀釋到mRNA 濃度的 1-3 倍。